Современное состояние и тенденции развития иммуноферментного анализа

Широкое распространение за рубежом, особенно в последнее десятилетие, для диагностики инфекционных, аллергических, аутоиммунных, гормональных расстройств получил иммуноферментный анализ (ИФА). Высокая чувствительность и специфичность твердофазного иммуноферментного анализа способствовали тому, что он стал в последние годы все более распространенным во многих странах благодаря простоте и доступности способов регистрации ферментативной активности. Упрощенные варианты твердофазного ИФА позволяют проводить полуколичественную оценку концентрации определяемых объектов без применения специальной аппаратуры, в полевых условиях, у постели больного. Относительная простота постановки и учета результатов реакции, высокая чувствительность порядка 10*Е-12 М при объеме пробы 0,1 мл, экспресность, возможность автоматизации и массового обследования образцов обусловили практическую пригодность ИФА. Интерес к ИФА в последние годы неуклонно возрастает, о чем свидетельствует появление ряда обзоров, посвященных методическим аспектам анализа [1-10], его применение в различных областях инфекционной [5, 11-14] и неинфекционной диагностики [5, 11]. интенсивное патентование методов иммунохимического анализа в странах Западной Европы, США. Японии.


В США выполняется наибольшее число иммуноферментных анализов, поэтому в организации их проведения главную роль играют экономические факторы. Новой тенденцией, получившей особое развитие благодаря программе медицинского обслуживания Medicare, стало выполнение анализов не в крупных больницах и коммерческих лабораториях, а в кабинете врача или прямо на дому у пациента. Согласно этой программе каждый пациент должен быть отнесен к одной из 467 диагностических групп, имеющих определенный предел по оплате стоимости лечения. Поэтому администрация клиники не может назначить слишком много анализов поступившему больному. Внелабораторные анализы США получили дальнейшее развитие в результате растущей популярности программ, проводимых Health Maintenance Organizations (HMO), и Preferred Provider Organizations (PPO). По контракту с HMO пациенту предоставляется однократная медицинская помощь на определенную сумму, в то время как РРО работает по долговременным страховым контрактам. В связи с этим обе организации и клинические лаборатории отдают предпочтение быстрым и сравнительно дешевым методикам иммуноанализа.

В Великобритании объем применения иммуноанализа для целей клинической диагностики оценивается в 30 млн. условных пробирок в год. Примерно 60% анализов выполняется с использованием реагентов собственного изготовления Четвертая часть всех анализов выполняется с использованием нерадиоактивных методов. Количество анализов без радиоактивных меток, выполняемых микробиологами и иммунологами, гораздо выше и составляет 92%. Больше всего анализов выполняется для обнаружения поверхностных антигенов вируса гепатита В, антител и ВИЧ. Наибольшая доля анализов приходится на известные методы, такие как латексная агглютинация и реакция связывания комплемента. Для Великобритании в области иммуноанализа характерны:

  • высокая централизация аналитической службы, иммуноанализы выполняются в немногочисленных больших лабораториях (около 400);
  • отсутствие тенденций к разработке единичных индивидуальных анализов;
  • преимущественное применение реагентов собственного изготовления (около
  • 60% по сравнению с 5% в Европе);
  • малое число выполняемых анализов по сравнению с общими потребностями населения страны.

Финансовый обзор состояния мирового рынка датчиков и прогноз его развития до 2001 г., сделанный швейцарской фирмой Intеchno Consulting AG показывает, что среднегодовое увеличение спроса на мировом рынке датчиков ожидается между 1991 г. и 2001 г., причем на биодатчики ожидается увеличение спроса на 20% [15].

Различные варианты ИФА характеризуются общими этапами В твердофазном ИФА один из специфических реагентов иммобилизуют на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специфические реагенты, проводя после инкубации каждого из них промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. Поэтому ферментативная активность образовавшегося на твердой фазе специфического комплекса будет пропорциональна концентрации каждого компонента этого комплекса, один из которых подлежит определению. Разработанные варианты ИФА различаются типом твердой фазы и способами присоединения к ней первого специфического реагента, числом и последовательностью добавления остальных специфических реагентов, способом промывки твердой фазы, способом получения конъюгата, природой фермента в конъюгате, типом используемого субстрата, способом выражения результатов анализа и т.д. Таким образом в каждом варианте ИФА можно выделить следующие общие этапы:

  1. получение иммуносорбента;
  2. формирование многослойного комплекса на твердой фазе за счет последовательного проведения специфических реакций;
  3. удаление неспецифически связавшихся компонентов, а также их избытка;
  4. получение ферментного конъюгата;
  5. измерение ферментативной активности специфического комплекса на твердой фазе:
  6. обработка и интерпретация результатов анализа.

Наиболее распространенная процедура твердофазного ИФА предусматривает использование микроплат из полистирола, карбоксилированного сополимера стирола или поливинилхлорида с фиксированным в лунках антигеном или антигеном, с ручной или полуавтоматической дозировкой реагентов и автоматической регистрацией оптической плотности на специальных фотометрах с вертикальным лучом. Обычно антитела и белковые антигены фиксируются на материале микроплат путем простой сорбции при инкубации в течение 12-24 ч Многими фирмами поставляются наборы, включающие микроплаты с уже фиксированным реагентом с гарантийным сроком хранения 6 месяцев. Физическая сорбция реагента на твердой фазе происходит за счет гидрофобных, донорноакцепторных взаимодействий или водородных связей. Величина отрицательного поверхностного заряда твердой фазы не коррелирует с интенсивностью взаимодействия пластик - белок, что указывает на отсутствие электростатической адсорбции [16].

При взаимодействии белка с полимером вначале образуется многомолекулярный слой, при этом конформация белка не претерпевает заметных денатурационных изменений. Избыток белка приводит к многослойной сорбции за счет белок - белковых взаимодействий. Многослойная сорбция, как правило, должна быть сведена к минимуму. В противном случае слабосвязанные специфические реагенты реагируют с добавленными иммунореактивными и образующийся комплекс удаляется после каждого этапа промывки. Это приводит к уменьшению чувствительности анализа и увеличению разброса результатов. Количество десорбированного реагента может составлять 60-70% от первоначального [17]. Устранение многослойной сорбции достигается за счет многократной промывки твердой фазы. Вторым подходом, уменьшающим многослойную сорбцию, является использование оптимальной концентрации реагента, которая лежит в интервале 1-10 мкг/мл.

Количество сорбированного белка, а тем самым и чувствительность анализа определяется природой твердой фазы и природой специфического реагента [18]. Гладкие полимерные поверхности полистирола, поливинилхлорида, полипропилена и др., выполненные в виде 96 - луночных планшетов, шариков, пробирок и других литьевых форм, обладают удовлетворительной сорбционной емкостью, составляющей 4 нг/мм2 [6, 19].

Более высокую сорбционную емкость имеют суспензии за счет увеличения суммарной поверхности и гораздо большей сорбционной способностью обладают пористые мембраны из нитроцеллюлозы или полиамидов [20, 21].

Не все белки сорбируются на полистироле достаточно быстро и прочно; эффективность сорбции повышается, если нанести на поверхность лунок носителя тонкий слой нитроцеллюлозы. Для улучшения сорбции отрицательно заряженных белков и нуклеиновых кислот предварительно сорбируют на полистироле полилизин или метилированный по карбоксильным группам альбумин. Сорбция различных белков, в том числе иммуноглобулинов М, А, Е значительно облегчается после их модификации 2, 4 -динитрофторбензолом.

Одним из способов стабилизации белков, иммобилизированных на носителе, является выдерживание материала перед его высушиванием, в растворе, содержащем сахарозу. Воспроизводимость анализов повышается (вариация менее 5%) при иммобилизации на полистироле с минимальным (до 1%) содержанием добавок - классификаторов, стабилизаторов, наполнителей. Нашли практическое применение рекомендации по упрочнению связи белка с полимерным материалом химическими методами, путем обработки поверхности глутаральдегидом, формальдегидом, производными бис - диазобензидина. Повышение эффективности работы на микроплатах достигается также путем подавления неспецифического связывания за счет включения во все рабочие растворы неионных или цвиттерионных детергентов, роданида калия, солей поливалентных анионов.

Основные недостатки методов физической сорбции могут быть устранены за счет ковалентного присоединения специфического реагента к твердой фазе. Ковалентное связывание белка с носителем происходит после поверхностной модификации полистирола нитрованием, восстановлением до аминогрупп и активацией диазотированием, или при карбодиимидной иммобилизации на микроплатах с покрытием из полистирола бутадионового карбоксилированного латекса.

Сравнение методов физической сорбции и ковалентного связывания показало [17]. что десорбция специфического реагента составляет 30% для полистирола, 60% для нейлона и только 13% для бромциан-активированной бумаги. Сорбционная емкость при ковалентном связывании в 5-10 раз выше, чем при физической сорбции. Чувствительность анализа при использовании в качестве твердой фазы бромциан- активированной бумаги только в 2 раза выше, чем при использовании полистирола. Ковалентное присоединение к частично гидролизованному нейлону обеспечивает 30 - кратное увеличение сорбционной емкости по сравнению с физической сорбцией на полистироле. Однако увеличение чувствительности анализа значительно меньше, чем увеличение количества сорбированного специфического реагента. Поэтому основным преимуществом ковалентного связывания является более высокая воспроизводимость результатов и возможность многократного использования иммобилизированной твердой фазы.

Методы комбинированной сорбции при всей привлекательности методов химической сорбции не получили широкою распространения из-за трудоемкости проведения.

Получили распространение носители для твердофазного ИФА в виде шариков диаметром около 6 мм из полистирола или найлона, применяемых как при работе на микроплатах или пробирках, так и с использованием специальных анализаторов - манипуляторов. Иммобилизация на найлоновых шариках, обычно обработанных соляной кислотой для частичного гидролиза амидных связей на поверхности носителя, проводится путем ковалентного присоединения антител или антигенов. Во всех случаях значительного ускорения в установлении равновесия в реакции антиген-антитело можно достигнуть если механическое перемешивание, встряхивание заменить ультразвуковой обработкой.

Макроносители различной формы из синтетических материалов являются конструктивными элементами различных устройств для ИФА, позволяющих упростить операции с растворами и измерение ферментативной активности. Так, пробирки с рельефной формой дна для увеличения площади, на которой происходит иммобилизация, комплекты полиэтиленовых пробирок с сорбированными антителами, двухкамерные пробирки с вынимаемым стержнем, на концах которого закреплен пучок волокон с иммобилизованным компонентом, трехкамерный миниконтейнер, содержащий лиофилизованные реагенты и шарик с иммобилизованным антителом и др.
Наибольшее применение мелкодисперсных носителей в твердофазном ИФА получили в колоночном анализе, перспективность которого определяется, в частности, тем. что проточные методы анализа легче всего поддаются автоматизации. Простейший проточный анализатор представляет собой трубку или набор трубок с ковалентно иммобилизированным на их внутренней поверхности иммунореагентом. Автоматическое устройство обеспечивает попеременный выпуск в трубки пробы в смеси с конкурентным лигандом, меченным ферментом, а затем промывного раствора с раствором субстрата. Разработаны также и многослойные колонки для одновременного открытия нескольких антигенов с помощью соответствующих им иммобилизованных антител.

Следует отметить применение в качестве носителей листовых материалов. Свойство нитроцеллюлозных мембран необратимо сорбировать белки, нуклеиновые кислоты, вирусы, клетки в последнее время чаще используется не только для получения отпечатков ("блоттинг") электрофореграмм и их иммуноферментного проявления, но и для ИФА капельным методом. Капельный метод анализа на пористых мембранах позволяет обходиться минимальным количеством пробы и реагентов. Менее экономичный путь пропитки всего листа реагентом и инертным белком с последующим нанесением пробы и проявлением, но он более удобен для работы в мало приспособленных условиях.

При выполнении капельной реакции на непористом носителе количество связанного ферметного конъюгата может быть определено по диаметру окрашенных пятен в содержащем субстрат слое агара, наложенном на поверхность носителя после отмывки несвязавшегося конъюгата.

Неотъемлемой, составной частью любого ИФА является применение различных ферментов, конъюгатов. Ферменты должны удовлетворять следующим требованиям [1]:

  • доступность в чистом виде;
  • простота и чувствительность методов определения продуктов ферметативной реакции;
  • высокая стабильность и активность конъюгатов при хранении и в условиях выполнения анализа.

Наиболее широкое применение нашла пероксидаза хрена Она остается самым популярным ферментом и не только потому, что относится к числу доступных, стабильных и легко определяемых. Помимо прямого использования в качестве метки, неконыогированная пероксидаза применяется в ИФА в качестве реагента для измерения активности ферментов, генерирующих перекись водорода в качестве одного из продуктов ферментативного акта-глюкозоксидазы и других оксидаз. Преимущество пероксидазы перед многими ферментами состоит также в том, что она является гликопротеином и может быть ковалентно связана с другим белком или лигандом через свой углеводный фрагмент путем периодатного окисления последнего, причем при соблюдении мягких условий окисления.

Представляется маловероятным, что поиск новых ферментов приведет к существенному повышению чувствительности анализов. Более перспективны, вероятно, пути увеличения количества связанною фермента в коньюгате или применение комбинаций ферментов - так называемый метод "каскадной амплификации".

Анализ основных путей развития по которому идут зарубежные фирмы в создании усовершенствованных методов твердофазного ИФА, позволяет предполагать, то дальнейший прогресс будет зависеть скорее всего от создания новых высокочувствительных способов детекции продуктов ферментативной реакции, то есть от прогресса аналитической биохимии, чем от введения в практику новых ферментов. Можно ожидать существенного повышения чувствительности на пути использования сопряженных реакций двух и более ферментов, что, однако, связано с усложнением системы подготовки и дозировки реагентов.

Ю.Г. Башлык, канд. техн. наук В.Г. Махортов

Список литературы:

  1. "Твердофазный иммуноферментный анализ". Сборник научных трудов, -., Изд.института им.Пастера, 1988 г.
  2. У.П.Коллинз, "Новые методы иммуноанализа", М., "Мир", 1991 г.
  3. Дзантиев Б.Б. ЖВХО. - 1982 г. -Т 27.
  4. Avrames S.et.al. Immunoluzymatic tecniques. - Amsterdam: Elsevier. 1983.
  5. Enzyme immunoassay. Jshikawa E.et.al.ed. - Tokyo - n.J.Jqaku -Shoin, 1981
  6. Lovborn U. Gnide tusolid phase immunoassays.- A/S Hune, Roskilde. Denmark, 1984.
  7. Methods of enzymatic analijsis- Berqmeyer N.G.ed., Weinheim: Verlag Chemie, 1983.
  8. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassays. Amsterdam e.d.:Elsevier, 1985.
  9. Volter A. etal. Immunoassay for the 80-s. Lancaster: MTR. 1981.
  10. Wood W.C. Immunoassay technology. Berlin e.a. 1985.
  11. Методы иммуноферментного анализа в биологии и медицине. - М., Медицина, 1983 г.
  12. Conradie J.D. et. al. Immunol. Meth. - 1983 - V 59.
  13. Immunoassay for clinical chemistry. Hunter W.M. Corric J.E.T.ed.- Edinburgh: Churchill Levintrone. 1983.
  14. Kurstak. Enzyme immunodiagnosis. - Orlando e.a.: Academic Press, 1986.
  15. Системы, приборы и методы контроля качества окружающей среды.РЖ №7, 1992 г.
  16. MacRitchic F.J. Colloid Interface Sei - 1972- V 38.
  17. Lentonen O.P., Veljanen M.K. Immunol. Meth. -1980 -V. 34.
  18. Contarero L.A. et.al.Anal.Beochem. -1980-V. 105.
  19. Butter J.E. Metods Enzymol -1981 -V.73.
  20. Giallongo A.et.al. Immunol. Meth - 1982 - V. 52.
  21. Wakamura J. Etal.J. Biol.Chem. - 1983 - V. 258.


 

Реклама товаров для здоровья

Новые комментарии