Выбор и обоснование направления разработки биологических сенсоров для ИФА анализа

Поиск и создание новых типов высокоэффективных дешевых биосенсоров, входящих в состав аналитических систем для целей иммуноферментного анализа, является одной из актуальных задач. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов состоят из двух главных частей: датчика с ферментом и прибора с помощью которого проводятся измерения хода реакции. В качестве приборов применяются спектрофотометры, спектрофлуориметры, хемилюминисцентные установки, термисторы и электрохимические датчики. Последние объединяют широкий класс потенциометрических и амперометрических электродов.


Требования, предъявляемые к биосенсорным материалам, обусловлены с одной стороны клинической необходимостью, с другой - целями и задачами фундаментальных исследований в биологии, весьма высоки: прежде всею материалы должны быть биологически нейтральны, обеспечивать протекание реакции с большой скоростью при малых энергетических затратах, селективны по отношению к осуществляемым реакциям, специфически связывать заданный лиганд, обеспечивая равномерное распределение его по всей рабочей поверхности в течение заданного времени, коррозийную стойкость, проводить электрический ток, быть стойким к физическим воздействиям.

Необходимость создания новых биосенсоров обусловлена еще и тем, что широкоиспользуемые 96-луночные титровальные планшеты обладают рядом недостатков и в неполной мере отвечают возросшим требованиям практики сегодняшнего дня. Проведенные исследования и анализ ошибок, связанных с неоднородными свойствами планшетов, оценки сорбционной способности по белку, однородности сорбции, показали ограниченность области использования, проблематичность применения в области высокоточных экспериментов, а в некоторых случаях и на невозможность применения. Сравнительный анализ [1] сорбционных свойств и однородности сорбции полистирольных планшетов целого ряда ведущих зарубежных фирм: Nune - Дания, Dynatech - Германия, Costar - Нидерланды, Grainer - Германия, Libra - Великобритания, Kohinoor -Чехия, ГосНИИ медицинских полимеров - Москва, Ленмедполимер - Санкт-Петербург приведены в таблице 1. Полученные данные свидетельствуют о том, что зарубежные планшеты обладают самыми различными сорбционными свойствами, при этом только первые три вида планшет фирм Nune, Dynatech и Co-star обладают как высокой сорбционной способностью, так и высокой однородностью сорбции (вариация 5-6%), что позволяет достичь высокой чувствительности анализов. Эти планшеты признаны пригодными для использования в количественном иммуноферментном анализе (ИФА) [2].

Таблица 1. Сравнительный анализ сорбционных свойств и однородности сорбции полистирольных планшетов зарубежных фирм

Вид планшета (полимер)

Фирма изготовитель, страна

Среднее значение оптической плотности

Коэффициент вариации сорбции, %

Цельные М 129 В (ПС)

Dynatech, Германия

0,519

5,8

Разборные НВ (ПС)

Nune, Дания

0,504

4,9

Разборные (ПЭТФГ)

Costar, Нидерланды

0,554

4,4

Разборные (ПС)

Grainer, Германия

0,364

5,7

Цельные (ПХВ)

Costar, Нидерланды

0,301

4,3

Цельные (ПС)

Librо, Великобритания

0,214

7,2

Разборные MB (ПС)

Nune, Дания

0,15

5,1

Цельные (ПС)

Kohinoor, Чехия

0,11

8,1

Разборные после у - облучения (ПС)

ГосНИИмедполимер

0,414

4,3

Разборные (ПС)

ГосНИИмедполимер

0,235

6,1

Цельные после отмывки гептаном

Ленмедполимер

0,228

13,9

Цельные (ПС)

Ленмедполимер

0,156

14,8

НB - высокое связывание белка; MB - среднее связывание белка; ПС - полистирол;
ПХВ - поливинилхлорид; ПЭТФГ - полиэтилентерефталатгликоль.

Вызывают интерес оценки погрешности в оптическом диапазоне (X = 492 нм), обусловленные флуктуацией толщины данной части планшетов. Оценка проводилась на серии полистирольных микропланшет, изготовленных в Нижнем Новгороде, с помощью спектрофотометра "Multiscan Plus". Результаты исследований показали, что оптическая плотность донной части меняется от лунки к лунке, флуктуация плотности распределена по нормальному закону, коэффициент вариации составляет в среднем 6,5% при диапазоне изменений значений от 4% до 12,5%

Таким образом, сравнительный анализ зарубежных и Российских планшетов для ИФА показал, что наиболее распространенные планшеты производства Ленмедполимер значительно уступают лучшим зарубежным аналогам как по сорбционной способности, так и по однородности сорбции белков, тогда как планшеты ГосНИИмедполимер не удовлетворяют требования количественного ИФА только по сорбционной способности относительно белка. Применение планшетов в ИФА ставит вопрос о стандартизации их параметров Это касается прежде всего стандартизации адсорбционных свойств, обеспечивающих одинаковое присоединение лигандов при внесении их в лунки планшетов, минимальную вариацию как внутри планшета так и между планшетами одной партии, а также между партиями планшетов.

Дальнейший поиск возможных путей создания новых биосенсоров показывает, что наиболее полно этому отвечает направление, связанное с разработкой модифицированных электродов, поскольку их свойства могут быть целенаправленно изменены путем варьирования поверхностного состава. Модифицированные электроды представляют собой электропроводную подложку, на которой закреплены заданные лиганды, полимерные комплексы и ферменты [3]. Наиболее широко используемые подложки - платина, золото, оксиды, силициды, нитриты металлов, углеродные материалы, а также полистирол, карбоксилированный сополимер, стирол, поливинилхлорид, найлон и др.

Модифицированная поверхность электрода должна обеспечивать прочную связь электроактивного соединения с поверхностью и осуществлять обмен электронами между подложкой и субстратом с высокой скоростью, высокую концентрацию активных центров рабочей поверхности Многочисленные методы приготовления модифицированных электродов могут быть обобщены на следующие основные направления:

  • формирование поверхности электрода, обеспечивающего адсорбционное привязывание белков за счет физической адсорбции;
  • разработка композиционных материалов - полимеров с высокими селективными адсорбционными свойствами;
  • изменение сорбционных свойств рабочей поверхности путем воздействия различных видов облучения: у - облучение, ультрафиолетовое (УФ), применение ультразвука и др.

Известно, что сорбционная способность полистирольных планшетов возрастает после обработки их у - облучением или УФ - излучением [1]. Этот эффект объясняется тем, что сорбция белков на поверхности необлученного полистирола осуществляется в основном за счет гидрофобного взаимодействия полимера и макромолекул белка, тогда как в результате облучения полистирола на воздухе на его поверхности образуются перекисные и гидроперекисные группы и связывание белка с поверхностью происходит не только благодаря гидрофобным взаимодействиям, но и в результате взаимодействия полярных групп полимера с гидрофильными участками белковых макромолекул. Модификация поверхности полистирола как с помощью радиационного, так и УФ облучения позволяет практически использовать модифицированные планшеты как для качественного, так и для количественного ИФА, причем новые характеристики сохраняются практически в течение 12 месяцев.

Среди всего ряда материалов, используемых в качестве электродов, особое место занимает углеродный материал, обладающий рядом уникальных свойств - биологическая нейтральность, электропроводность, высокие сорбционные свойства в силу своей пористой структуры, возможность синтезировать углеродный материал с заданной структурой, пористостью, составом поверхностных групп в контактной или дисперсной формах.

Применение углеграфитового материала в чистом виде из-за его особых свойств весьма ограничено. Графит чаще всего используется в качестве наполнителя в углеграфитовых композиционных материалах (УКМ). Широкое распространение получили композиты на базе многокомпонентных смесей: графит-сажа-связующее, графит-графит-сажа-связующее с последующим уплотнением в виде спекания, прессования, накатывания и т.п. Композиционные материалы на основе графитосажевой смеси являются одними из наиболее распространенных в промышленности углеграфитовых материалов. Это объясняется, манным образом, значительными различиями в дисперсности указанных компонентов и возможностью в связи с этим приготовления из них изделий с максимальной упаковкой, достигаемой заполнением сажей пор между частицами графита. В зависимости от назначения композиционного материала, изменяя составляющие смесей, технологию приготовления можно получить материалы с теми или иными характеристиками. Введение связующею позволяет снизить модуль упругости, увеличить объем прессуемого материала, уменьшить анизотропию, обеспечить наибольшее развитие поперечных связей. Такие композиционные материалы обладают высокими адсорбционными свойствами в силу своей пористой структуры Известно [4], что чем больше величина удельной поверхности пористого УКМ и ее доступность для адсорбирующихся молекул, тем выше селективность сорбционного процесса. Активность пористых УКМ должна быть пропорциональна величине удельной поверхности, соприкасающейся с адсорбирующим веществом Справедливость такого утверждения имеет реальный смысл лишь при допущении энергетической однородности поверхности пористого УКМ. равномерном распределении его активных центров по площади и равной силе их взаимодействия с молекулами адсорбента. Поскольку химическая природа поверхности реальных адсорбентов характеризуется неоднородностью, которая индуцируется взаимодействием между адсорбированными молекулами, то избирательность и результативность работы адсорбента будет зависеть от распределения активных мест по их доступной поверхности [4-7].

Ю.Г. Башлык, канд. техн. наук Л.П. Евтеева, В.Г. Махортов

Список литературы:
1. И.Ф Бурдыгина Н.А., Венгерова. Б.С. Эльцефон, - Биотехнология. 1994 г., № 11-12.
2. Brunangelo F., Taylor С. Arch.Pathol.lab. Med. - 1983 - V.107. - №3.
3. Murroy R.W.In. Electroanalytical Chemistry.A. Series of Advances, Vol 13 Ed. Barel A.J. New Jork - Basel; 1984,
4. B.C. Комаров, Адсорбенты и их свойства. - М., - Наука и техника, 1977г.
5. Н.В. Кельцов, Основы адсорбционной техники. - М., - Химия, 1984 г.
6. С.Грег, К.Грег, Адсорбция, удельная поверхность, пористость. - М., - Мир.
1984 г.
7. В.И. Косников. Г.В. Белов, Гидродинамика пористых графитов. - М., - Металлургия, 1986 г.



 

Реклама товаров для здоровья

Новые комментарии