Результаты экспериментальной оценки свойств планарных углеграфитовых электродов, используемых в ИФА

Оценка свойств планарных углеграфитовых электродов осуществлялась на заключительной стадии проведения ИФА путем измерения каталитической активности ферментативной метки. Регистрируемый при этом параметр однозначно соответствует начальной концентрации измеряемого соединения и служит характеристикой его содержания [1-3]. Величины, в которых выражается регистрируемый сигнал, могут быть различны и зависят от метода определения ферментативной активности. Мера, наиболее распространенная на практике, как правило, выражается в единицах оптической плотности, веса антител, сорбированных на единичной площади, минимального веса обнаруживаемых антигенов и др. Измерения каталитической активности ферментативной метки для оценки свойств электродов проводились спектрофотометрическим и электрохимическим методами.


Особенностью проведения экспериментальных работ по оценке свойств элекгродов в оптическом диапазоне является то, что раствор фермента наносился на рабочую поверхность электрода как капельным способом, так и погружением электродов в раствор с ферментом. Фермент представляет собой раствор пероксидазы хрена в дисцилированной воде с концентрацией 10 мкг/мл, а субстратный буфер-раствор 0,0025% ортофенилендиамина (ОФД) на натриацетатном буфере и 0,006 % перекиси водорода на дисцилированной воде.

Для экспериментов брались 96 - луночные полистироловые планшеты, в которые раскапывалось по 10 мкл раствора фермента концентрации 10 мкг/мл. Часть планшетов выдерживалась в течение 18 часов при температуре t = 20°С, а часть в холодильнике при температуре t = + 4°С. Партия из сорока углеграфитовых электродов погружалась в лунки с 0,2 мл раствора фермента концентрации 10 мкг/мл. Половина партии электродов выдерживалась в течение 18 часов при температуре 1 = 20°С, а вторая половина в холодильнике при t = + 4°С. На вторую партию из сорока углеграфитовых электродов наносился капельным способом по 10 мкл раствор фермента и половина из них выдерживалась при t = 20°С. а вторая половина при t = + 4°С.

Половина лунок полистироловых планшетов перед проведением реакции промывалась путем заполнения лунок дисцилированной водой на одну минуту с последующим отсасыванием воды. Затем во все лунки планшетов вносилось по 0,2 мл субстратного раствора, а через 5 минут во все лунки добавлялось 0,05 мл стоп-реагента.

Аналогично из каждой партии электродов перед проведением реакции часть электродов промывались путем погружения в лунки с дисцилированной водой на одну минуту. Затем в чистые лунки планшетов вносилось по 0,2 мл субстратного раствора, в который погружались электроды с сорбированным ферментом. Через 5 минут во все лунки добавлялось по 0,05 мл стоп-реагента. Измерения значений оптической плотности проводились на приборе КФК - 2 на длине волны 490 нм. Результаты измерений приведены в таблице 1.

Тип Углеграфитовые электроды 96-луночные планшеты
раскапывание фермента погружение электрода в раствор t=+20 t=+4
t=+20 t=+4 t=+20 t=+4 без про-
мывки
про-
мывка
без про-
мывки
про-
мывка
без про-
мывки
про-
мывка
без про-
мывки
про-
мывка
без про-
мывки
про-
мывка
без про-
мывки
про-
мывка
Оптическая
плотность
0,75 0,28 0,84 0,57 0.71 0,54 0,66 0,55 0,75 0,33 0,71 0,38

Таблица 1. Результаты измерений оптической плотности.

Сравнительный анализ полученных результатов и данных по зарубежным материалам показывает, что по сорбционной емкости (табл. 2) углеграфитовые электроды находятся на уровне лучших зарубежных образцов.

Параметры сорбционной емкости Углефафитовый электрод Dynatech Германия цельные М 129 В (ПС) Grainer Германия разборные (ПС) Ленмедполимер Россия цельные (ПС)
Оптическая плотность 0,57 - 0,55 0,519 0,364 0,156
Коэффициент вариации сорбции % 7,1 5,8 5,7 14,8

Таблица 2. Сравнение сорбционной емкости углеграфитовых электродов с зарубежными образцами.

Экспериментальная оценка свойств углеграфитовых электродов электрохимическим методом - измерение редокс потенциала - проводилась путем сравнения временных процессов изменения потенциала окислительно-восстановительной реакции эталонной парой стандартных электродов, состоящей из индикаторного платинового электрода ЭПЛ-02 и хлорсеребряного электрода ЭВЛ-1М4 с процессами вновь образованной пары электродов путем замены одного из электродов на углеграфитовый электрод.

Для работы готовился раствор, состоящий из 1,7 мл натриацетатного буфера с рН 5 И добавлением 0,2 мл субстрата. Субстрат содержал 0,0025 % ортофенилендиамина на натриацетатном буфере и 0,006% перекиси водорода на дисцилированной воде. Через 15 секунд после начала эксперимента в измерительную ячейку вводился раствор пероксидазы хрена в объеме 0,1 мл различной концентрации от 1,95 нг/мл до 500 нг/мл. Измерения значений потенциала проводились в течение 15 минут по измерительной схеме, представленной на рис. 1.

Измерительная схема
Рис. 1. Схема для измерения потенциала раствора.

По каждой паре электродов проводилась серия измерений, состоящая из трех независимых, при равных условиях, экспериментов, результаты которых статистически обрабатывались с определением математического ожидания, дисперсии и коэффициента корреляции [4-5].

Полученные оценки характеризуются изменяющейся во времени среднеквадратической ошибкой (СКО). Для электродов платина-хлорсеребро харак-герно увеличение СКО как во времени так и с увеличением концентрации пероксидазы хрена Для электродов углеграфит + хлорсеребро в диапазоне концентраций пероксидазы хрена 1,95-125 нг/мл наблюдается уменьшение СКО во времени и наличие участка стационарности СКО (t > 100 сек), а при концентрациях >= 250 нг/мл наблюдается увеличение СКО во времени. Электроды углеграфит + хлорсеребро обладают в 3 - 4 раза меньшей СКО чем платина + хлорсеребрянный электрод. Анализ изменения зависимости СКО от концентрации нероксидазы хрена в разных сечениях времени показывает также на характерное увеличение СКО как во времени, так и от концентрации для пары электродов платина + хлорсеребро. Более стабильными значениями СКО обладает пара электродов углеграфит + хлорсеребро.

Ярко выраженное преимущество имеет пара электродов углеграфит + хлорсеребро над парами платина + хлорсеребро, платина + углеграфит при оценке СКО фонового значения субстрата. Пара углеграфит + хлорсеребро имеет СКО, практически не меняющейся во времени и 2-3 раза меньшей, чем СКО платина + хлорсеребрянная и плагина + углеграфитовая пары.

Практический интерес представляет вогтрос распределения случайной и систематической составляющих ошибок, создаваемых нарой электродов при измерениях основного значения потенциала Анализ характера поведения результатов измерений потенциала субстрата позволил выбрать линейную модель аппроксимации. Оценки суммарной СКО, случайной и систематических составляющих для трех типов электродов приведены в таблице 3

Тип
электрода
Составляющие
ошибок
Время, сек
20 40 100 150 200 900
платина + хлорсеребро СКОсум 18,13 17,52 15,81 14,81 14,45 7,55
СКОслуч 0,418 0,775 0,143 0,185 0,279 2,265
СКОсист 18,09 17,48 15,79 14,79 14,44 7,2
углерод + хлорсеребро СКОсум 2,65 2,8 2,7 2,7 2,7 3,05
СКОслуч 0,273 0,868 0,086 0,082 0,117 0,677
СКОсист 2,63 2.66 2,69 2,69 2,69 2,97
платина + углеграфит СКОсум 20,4 17,6 14,1 13.6 12,25 9.8
СКОслуч 0,817 0,723 0,056 0,126 0,237 1.937
СКОсист 20,38 17,58 14.09 13.59 12.24 9.6

Таблица 3. Оценка суммарной, случайной и систематических составляющих СКО для трех типов электродов.

Важное место занимает вопрос воспроизводимости результатов измерений. Степень сходимости результатов оценивалась по коэффициенту корреляции как в реализациях для одного типа электродов, так и в реализациях между разными парами электродов для различных концентраций пероксидазы хрена. Результаты оценки приведены в таблице 4.

Концентрация нг/мл Коэффициент корреляции
платина хлорсеребро углеграфит хлорсеребро платина углеграфит Платина + хлор-серебро
углегрфит хлорсеребро
1,95 0,47 0,99 0,5 0,02
31,3 0,45 0,99 0,81 0,85
62,5 0,93 0,98 0.95 0,83
125 0,94 0,98 0,96 0,94
250 0,99 0,99 0,92 0,95

Таблица 4. Результаты оценки степени сходимости.

Таким образом, проведенная оценка свойств планарных углеграфитовых электродов как оптическим так и электрохимическим методами показали высокие сорбционные свойства, воспроизводимость результатов, точность, временную стабильность. Оценка и анализ структуры погрешностей электродов подтвердили преобладание систематической составляющей над случайной составляющей, при этом наименьшей СКО обладает пара электродов углеграфит + хлорсеребро.

Авторы: Ю.Г. Башлык, канд. техн. наук, В.Г. Махортов, В.И Соколенко

Список литературы:
1. A.M. Егоров, А.П. Осипов, Б. Дзантиев, Е.М. Гаврилова, "Теория и практика иммуноферментного анализа", М., "Высшая школа", 1991 г.
2. Ю.Ю. Кулис, "Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов", В., "МОКЛАС", 1981 г.
3. Дж. Плэмбек, "Электрохимические методы анализа. Основы теории и применения", М., "Мир", 1985 г.
4. Н.И. Тихонов, М.В. Уфимцев, "Статистическая обработка результатов экспериментов", М., МГУ, 1988 г.
5. В.А. Грановский, Т.Н. Сирая, "Методы обработки экспериментальных данных при измерениях", Л., "Энергоатомиздат", 1990 г.centermiddle17,58td colspan=



 

Отправить комментарий

Содержание этого поля необходимо если Вы хотите подписаться на комментарии; является приватным, не предназначено к показу третьим лицам.
CAPTCHA
This question is for testing whether you are a human visitor and to prevent automated spam submissions.
To prevent automated spam submissions leave this field empty.

Реклама товаров для здоровья

Новые комментарии