Современные методы диагностики и лечения заболеваний

Поиск и создание новых типов высокоэффективных дешевых биосенсоров, входящих в состав аналитических систем для целей иммуноферментного анализа, является одной из актуальных задач. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов состоят из двух главных частей: датчика с ферментом и прибора с помощью которого проводятся измерения хода реакции. В качестве приборов применяются спектрофотометры, спектрофлуориметры, хемилюминисцентные установки, термисторы и электрохимические датчики. Последние объединяют широкий класс потенциометрических и амперометрических электродов.

Требования, предъявляемые к биосенсорным материалам, обусловлены с одной стороны клинической необходимостью, с другой - целями и задачами фундаментальных исследований в биологии, весьма высоки: прежде всею материалы должны быть биологически нейтральны, обеспечивать протекание реакции с большой скоростью при малых энергетических затратах, селективны по отношению к осуществляемым реакциям, специфически связывать заданный лиганд, обеспечивая равномерное распределение его по всей рабочей поверхности в течение заданного времени, коррозийную стойкость, проводить электрический ток, быть стойким к физическим воздействиям.

Необходимость создания новых биосенсоров обусловлена еще и тем, что широкоиспользуемые 96-луночные титровальные планшеты обладают рядом недостатков и в неполной мере отвечают возросшим требованиям практики сегодняшнего дня. Проведенные исследования и анализ ошибок, связанных с неоднородными свойствами планшетов, оценки сорбционной способности по белку, однородности сорбции, показали ограниченность области использования, проблематичность применения в области высокоточных экспериментов, а в некоторых случаях и на невозможность применения. Сравнительный анализ [1] сорбционных свойств и однородности сорбции полистирольных планшетов целого ряда ведущих зарубежных фирм: Nune - Дания, Dynatech - Германия, Costar - Нидерланды, Grainer - Германия, Libra - Великобритания, Kohinoor -Чехия, ГосНИИ медицинских полимеров - Москва, Ленмедполимер - Санкт-Петербург приведены в таблице 1. Полученные данные свидетельствуют о том, что зарубежные планшеты обладают самыми различными сорбционными свойствами, при этом только первые три вида планшет фирм Nune, Dynatech и Co-star обладают как высокой сорбционной способностью, так и высокой однородностью сорбции (вариация 5-6%), что позволяет достичь высокой чувствительности анализов. Эти планшеты признаны пригодными для использования в количественном иммуноферментном анализе (ИФА) [2].

Таблица 1. Сравнительный анализ сорбционных свойств и однородности сорбции полистирольных планшетов зарубежных фирм

НB - высокое связывание белка; MB - среднее связывание белка; ПС - полистирол;
ПХВ - поливинилхлорид; ПЭТФГ - полиэтилентерефталатгликоль.

Вызывают интерес оценки погрешности в оптическом диапазоне (X = 492 нм), обусловленные флуктуацией толщины данной части планшетов. Оценка проводилась на серии полистирольных микропланшет, изготовленных в Нижнем Новгороде, с помощью спектрофотометра "Multiscan Plus". Результаты исследований показали, что оптическая плотность донной части меняется от лунки к лунке, флуктуация плотности распределена по нормальному закону, коэффициент вариации составляет в среднем 6,5% при диапазоне изменений значений от 4% до 12,5%

Таким образом, сравнительный анализ зарубежных и Российских планшетов для ИФА показал, что наиболее распространенные планшеты производства Ленмедполимер значительно уступают лучшим зарубежным аналогам как по сорбционной способности, так и по однородности сорбции белков, тогда как планшеты ГосНИИмедполимер не удовлетворяют требования количественного ИФА только по сорбционной способности относительно белка. Применение планшетов в ИФА ставит вопрос о стандартизации их параметров Это касается прежде всего стандартизации адсорбционных свойств, обеспечивающих одинаковое присоединение лигандов при внесении их в лунки планшетов, минимальную вариацию как внутри планшета так и между планшетами одной партии, а также между партиями планшетов.

Дальнейший поиск возможных путей создания новых биосенсоров показывает, что наиболее полно этому отвечает направление, связанное с разработкой модифицированных электродов, поскольку их свойства могут быть целенаправленно изменены путем варьирования поверхностного состава. Модифицированные электроды представляют собой электропроводную подложку, на которой закреплены заданные лиганды, полимерные комплексы и ферменты [3]. Наиболее широко используемые подложки - платина, золото, оксиды, силициды, нитриты металлов, углеродные материалы, а также полистирол, карбоксилированный сополимер, стирол, поливинилхлорид, найлон и др.

Модифицированная поверхность электрода должна обеспечивать прочную связь электроактивного соединения с поверхностью и осуществлять обмен электронами между подложкой и субстратом с высокой скоростью, высокую концентрацию активных центров рабочей поверхности Многочисленные методы приготовления модифицированных электродов могут быть обобщены на следующие основные направления:

• формирование поверхности электрода, обеспечивающего адсорбционное привязывание белков за счет физической адсорбции;
• разработка композиционных материалов - полимеров с высокими селективными адсорбционными свойствами;
• изменение сорбционных свойств рабочей поверхности путем воздействия различных видов облучения: у - облучение, ультрафиолетовое (УФ), применение ультразвука и др.

Известно, что сорбционная способность полистирольных планшетов возрастает после обработки их у - облучением или УФ - излучением [1]. Этот эффект объясняется тем, что сорбция белков на поверхности необлученного полистирола осуществляется в основном за счет гидрофобного взаимодействия полимера и макромолекул белка, тогда как в результате облучения полистирола на воздухе на его поверхности образуются перекисные и гидроперекисные группы и связывание белка с поверхностью происходит не только благодаря гидрофобным взаимодействиям, но и в результате взаимодействия полярных групп полимера с гидрофильными участками белковых макромолекул. Модификация поверхности полистирола как с помощью радиационного, так и УФ облучения позволяет практически использовать модифицированные планшеты как для качественного, так и для количественного ИФА, причем новые характеристики сохраняются практически в течение 12 месяцев.

Среди всего ряда материалов, используемых в качестве электродов, особое место занимает углеродный материал, обладающий рядом уникальных свойств - биологическая нейтральность, электропроводность, высокие сорбционные свойства в силу своей пористой структуры, возможность синтезировать углеродный материал с заданной структурой, пористостью, составом поверхностных групп в контактной или дисперсной формах.

Применение углеграфитового материала в чистом виде из-за его особых свойств весьма ограничено. Графит чаще всего используется в качестве наполнителя в углеграфитовых композиционных материалах (УКМ). Широкое распространение получили композиты на базе многокомпонентных смесей: графит-сажа-связующее, графит-графит-сажа-связующее с последующим уплотнением в виде спекания, прессования, накатывания и т.п. Композиционные материалы на основе графитосажевой смеси являются одними из наиболее распространенных в промышленности углеграфитовых материалов. Это объясняется, манным образом, значительными различиями в дисперсности указанных компонентов и возможностью в связи с этим приготовления из них изделий с максимальной упаковкой, достигаемой заполнением сажей пор между частицами графита. В зависимости от назначения композиционного материала, изменяя составляющие смесей, технологию приготовления можно получить материалы с теми или иными характеристиками. Введение связующею позволяет снизить модуль упругости, увеличить объем прессуемого материала, уменьшить анизотропию, обеспечить наибольшее развитие поперечных связей. Такие композиционные материалы обладают высокими адсорбционными свойствами в силу своей пористой структуры Известно [4], что чем больше величина удельной поверхности пористого УКМ и ее доступность для адсорбирующихся молекул, тем выше селективность сорбционного процесса. Активность пористых УКМ должна быть пропорциональна величине удельной поверхности, соприкасающейся с адсорбирующим веществом Справедливость такого утверждения имеет реальный смысл лишь при допущении энергетической однородности поверхности пористого УКМ. равномерном распределении его активных центров по площади и равной силе их взаимодействия с молекулами адсорбента. Поскольку химическая природа поверхности реальных адсорбентов характеризуется неоднородностью, которая индуцируется взаимодействием между адсорбированными молекулами, то избирательность и результативность работы адсорбента будет зависеть от распределения активных мест по их доступной поверхности [4-7].

Ю.Г. Башлык, канд. техн. наук Л.П. Евтеева, В.Г. Махортов

Список литературы:
1. И.Ф Бурдыгина Н.А., Венгерова. Б.С. Эльцефон, - Биотехнология. 1994 г., № 11-12.
2. Brunangelo F., Taylor С. Arch.Pathol.lab. Med. - 1983 - V.107. - №3.
3. Murroy R.W.In. Electroanalytical Chemistry.A. Series of Advances, Vol 13 Ed. Barel A.J. New Jork - Basel; 1984,
4. B.C. Комаров, Адсорбенты и их свойства. - М., - Наука и техника, 1977г.
5. Н.В. Кельцов, Основы адсорбционной техники. - М., - Химия, 1984 г.
6. С.Грег, К.Грег, Адсорбция, удельная поверхность, пористость. - М., - Мир.
1984 г.
7. В.И. Косников. Г.В. Белов, Гидродинамика пористых графитов. - М., - Металлургия, 1986 г.